嘉靖二十九年（1550），吴百朋被提升为山西道监察御史，兼管长芦盐政，又负巡按江北的重任。
　　明初，日本一些在国内失意的土豪与浪人，在中国沿海地区，武装走私，抢掠商民，当时称为“倭寇”。
　　嘉靖二十九年（1550），吴百朋巡按江北，惩治贪官，打击豪强，访察民情，申雪冤屈，朝野为之震慑。当时，倭患猖獗，吴百朋殚精竭虑，多方筹划抗倭大计。他发现无为州城墙崩塌，无险可守，倭寇乘机屡屡侵犯，烧杀抢掠，百姓深受其害，苦不堪言。他当机立断，奏请朝廷“筑城御寇”。
　　吴百朋发出公告，劝谕乡绅百姓，大敌当前，要同仇敌忾。在他的倡导督促下，无为州是年七月初八开工，同年十月初告竣。城廓沟池，森严壁垒，众志成城，严阵以待。倭寇闻讯后，再也不敢侵犯无为州。时礼部尚书、武英殿大学士徐阶对此赞叹不已，受无为州黎民之托，曾撰《创建无为州城碑记》传世，并在记中赞叹云：无为州“唯赖吴君殆不免于焚劫”。
　　不久，倭寇首领冢原井、龟善太郎纠集一万余人，突侵瓜州，杀人放火，奸淫掳掠，百姓深恶痛绝，地方官束手无策，即使组织抵抗，也畏敌如虎，不堪一击。这更助长了倭寇的嚣张气焰，欲把魔爪伸向扬州。
　　扬州为兵家必争之地，更兼都市繁华，人口密集，为江南膏腴富庶之地，倭寇早就垂涎三尺，千方百计图谋取之。
　　吴百朋接到瓜州告急文书，立即飞檄调集各处兵马，驰援江苏重镇扬州。
　　在赴扬州救援途中，“望江上湛浮肢解皆淮卒”，更有一参将“以单舸遁”。百姓惶惶不安，扶老携幼，纷纷逃往扬州避难。扬州城下，数万难民，望城号哭，哀求入城。而扬州郡守下令已“阖门者三日”，拒纳难民入城。
　　吴百朋抵达扬州城下，出示印符文书后，方获入城。他气喘未定，当即指责督抚、郡守诸官员：“何以拒民不救？”督抚、郡守等面有难色。吴百朋声色俱厉，下令“开城纳民”，督抚、郡守不敢违抗，数万难民一拥而入。吴百朋传令妥善安置，免出意外。吴百朋临危不惧，神色自若，督抚与郡守等一再叩请吴百朋带兵御寇，并献上符印。
　　在这危急关头，吴百朋以民族利益为重，果断地挑起这副千斤重担。吴百朋号召全城军民全力以赴，激励他们说：“养兵千日，用兵一时，大敌当前，要以国家利益为重，要坚定信心，御敌自救，与扬州共存亡！”
　　吴百朋虽系文臣，但他自幼熟读兵书，加上平时注重兵略，所以调兵遣将，显得从容不迫，调度有方，众皆服之。
　　薄暮时分，倭寇前队5000余人已兵临城下，安营扎寨，等候后队兵至，企图合围，一举攻破扬州。
　　吴百朋分析敌情后，决定以攻为守，主动出击。乘倭寇立足未稳，出其不意，攻其不备。遂挑选三千精锐兵勇，以迅雷不及掩耳之势，出城掩杀。倭寇猝不及防，兵营大乱。明军奋勇争先，斩倭首4000余级。残敌闻风丧胆，狼狈逃窜。后队倭寇见大势已去，不敢轻举妄动，遂与前队溃兵“远遁”，对扬州城再不敢觊觎。
　　扬州之战，朝野震动。时任义乌知县的汪道昆喜闻捷报后，欣然赋诗为吴百朋祝贺：
　　使君宝剑七星明，截海扬帆断巨鲸。
　　开幕定传书记檄，飞符先召伏波兵。
　　大堤烟火连隋苑，高垒风云拥汉旌。
　　六月三师愁汗马，孤城桴鼓仗宏平。
　　扬州之战，对靖肃倭患，保护黎民百姓生命财产的安全，功不可没。战后，吴百朋加强城防，并奏请朝廷“筑东关外城，延袤十里”。从此，倭寇闻风丧胆，再不敢染指扬州。
　　朝廷论功行赏，扬州督抚以下诸官员悉受不同程度的处分，唯吴百朋受嘉奖，诏赐金帛，他又将所赐之物，悉数奖励下属。
　　扬州百姓感念吴百朋抗倭之大功，救命之大恩，立“吴公生祠”以祀焉。