自顺治六年(1649)后，抗清形势又急转直下，清政府征调大军，分路征讨，进占湖南，杀明军主帅何腾蛟于湘潭，次年又攻下广州、桂林，明朝广西巡抚瞿式耜被执后不屈而死。在清军步步紧逼下，桂王永历政权先迁浔州(今广西桂平)，再迁南宁，吴贞毓皆随从护驾。

清顺治三年，四川大西农民军在与清军决战时失利，张献忠牺牲，大西军余部孙可望占据云南。早在顺治六年，孙可望就曾谴使联络永历政权，要求永历帝封他为秦王，然后联合抗清，永历政府不同意其要求。此时，桂王政权为避清军继续逃难，孙可望派精兵五千迎永历帝于南宁，杀了不同意封其为秦王的永历帝首辅大臣严起恒以下大臣十余人，继续逼迫永历帝封其为秦王。吴贞毓也是当时不同意封孙可望为秦王的大臣之一，因其正出使在外，故幸免于难，待其出使归来，永历帝晋封其为东阁大学士以代严起恒职，成为永历帝心腹。

顺治八年，孙可望由云南进入贵州，占据贵阳。他为了挟天子以令诸侯，要求桂王政权迁到贵州。孙可望的部属曹延生憎恨孙可望的为人，向永历帝极言孙可望不可亲近。永历帝自己本不想依附孙可望，而欲逃避到海上去，但离海滨太远，以致陷于进退维谷走投无路的困境。吴贞毓既为首辅大臣，此前又曾阻封孙可望为秦王，此时也不敢决断永历帝的去所。这时，清军逼近永历政权已不足百里，有兵将仓促报告敌情，永历政府的官员们"上下失色，皆散去"。无奈之下，永历帝只得在吴贞毓的伴驾下走少数民族聚集区，由罗江土司到龙英，再到广南(今贵州安龙布依族苗族自治县)。九年二月，孙可望迎永历帝到贵州安隆所，并将安隆所改名为安龙府。在安龙府，永历帝的旧臣分化，执掌兵权的大臣马吉翔、司礼中官府庞天寿等人投靠了孙可望，欲拥立孙可望代替永历帝，他们痛恨吴贞毓不附和自己，令人交相上疏攻击他，吴贞毓的处境艰难起来。

永历帝觉察到了孙可望等人的野心和阴谋，为了摆脱孙可望的控制，欲联络张献忠的另一支余部、驻守广西的李定国，便与中官张福禄、全为国密谋联系李定国。张、全二人又联络大臣徐极、林青阳等，并与吴贞毓商议对策。吴贞毓说："主上忧危，正我辈报国之秋，诸军中谁能充此使者?"林青阳自告奋勇愿意前往。林青阳等秘密出使，他见到李定国后告知了永历帝的意图，李定国"接敕感泣，许以迎王"。但因路途不便，行动机密，一时不能回报永历帝。

顺治十年夏天，林青阳出使许久未归，永历帝欲再派使臣督促，吴贞毓推荐了翰林孔目周官。因担心马吉翔在军侧遣使不便，永历帝就派马吉翔为使到梧州祭先王及王太后陵，再派周官去督促李定国迎王。不料马吉翔在出使途中探听到了林青阳出使李定国的机密，派人到李定国营中侦探虚实。而此时李定国的主事刘议新在回奏永历帝的途中，又巧遇马吉翔一行，他自以为马吉翔也参与了永历帝联合李定国之事，就把永历帝两次派使臣到李定国营中的详情告诉了他。马吉翔闻言惊恐万状，匆匆报告了孙可望。孙可望大怒，立即派其部将郑国将诸人逮捕，郑国怀疑马吉翔也参与了其事，也将他一起逮到安龙府对质。吴贞毓开始说不知情，郑国大怒，把他逮至永历帝面前，逼迫永历帝指出主谋之人。永历帝不敢实说，推说可能是外人假借皇印而为之事，"悲愤而退"。